冷冻电镜为什么会在电子显微镜领域热起来？2017年诺贝尔化学奖简介

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冷冻电镜热起来——2017年诺贝尔化学奖简介

2017年度的诺贝尔化学奖授予了瑞士洛桑大学科学家雅克·杜邦内特、美国哥伦比亚大学科学家约阿希姆·弗兰克和英国剑桥大学科学家理查德·亨德森，以表彰他们在开发可以用于研究生物分子高分辨率结构的“冷冻电镜”技术方面的杰出贡献。

说起电子显微镜，人们或许都不陌生，它是一种分辨率比光学显微镜更高，可以看到光学显微镜下看不到的微观世界的仪器。那什么是冷冻电镜呢？总不会是把电子显微镜冷冻起来吧？这种冷冻电镜技术又为什么能够用于研究生物分子的结构呢？3位科学家30多年前的研究为什么直到现在才获得诺贝尔奖委员会的青睐呢？下面就让我们一一揭开这些问题的答案。

“结构三剑客”

毫无疑问，电子显微镜是科学家用来探索微观世界的利器。但微观世界也不是一概而论的，在尺度上跨越了多个数量级。

通常说到生物学上的微观世界，人们想到的大概会是各种寄生虫和细菌，大小从几百微米直至几微米。相比之下，头发丝直径大概是不到100微米。要想看清楚这样的微观结构，就要借助光学显微镜。最好的光学显微镜能够看到细胞内部细胞器的结构，通过一些特殊技术甚至能够看到单个的蛋白质分子。

说到物理学上的微观世界，人们想到的大概就是分子和原子了。要想“看”到单个的原子，只有借助扫描隧道显微镜或是原子力显微镜才行，但这些设备对观测样品的限制非常多，实际应用领域比较狭窄。应用得更为广泛的是电子显微镜，虽然它不能直接观测到单个的原子，但是对于光学显微镜下的微观世界，电子显微镜能够提供更为清晰、分辨率更高、细节更为丰富的照片。

近一个世纪以来，生物学家也有了观察分子级别，甚至是原子级别微观世界的需求。再复杂的细胞、细胞器也都是由各种生物分子，特别是蛋白质等生物大分子构成的，要研究这些蛋白质的功能，最直接的方法就是“看到”它们的三维结构，也就是测定构成一个蛋白质分子的成千上万个原子的三维坐标。研究生物大分子结构的科学就是结构生物学。

要想测定蛋白质的结构可并不容易。蛋白质的大小只有几纳米到几十纳米，比细胞小了1000倍，甚至小于可见光的波长，因此超越了光学显微镜的极限。为了描述蛋白质中各个原子的坐标，就连纳米这样的单位都显得太“大”了，所以生物学家使用了“埃”（angstrom）这个长度单位，指10-10米，也就是0.1纳米。

为了探索“埃”这个水平上的微观世界，科学家发展出了三种不同的方法，堪称“结构三剑客”。它们之中的老大是X射线晶体学，通过X射线在蛋白质晶体上的衍射来计算蛋白质的结构。这种方法发展得最为成熟，应用最为广泛，观測到的蛋白质结构分辨率也最高，能够达到1埃的水平，清晰地分辨出每一个原子的准确位置。但是X射线晶体学首先需要把蛋白质结晶，而蛋白质并不都能老老实实地排列成整齐的晶体，因此限制了这种方法的应用。

三剑客中的老二是核磁共振方法。这种方法无需结晶，可以直接测定溶液中的蛋白质结构，但是却有蛋白质大小方面的限制。太大的蛋白质产生的核磁共振谱图过于复杂，重叠严重，变得无法解读。另外，由多个蛋白质组成的蛋白质复合物也难以用核磁共振的方法直接观测结构。

结构三剑客中的最后一位就是电子显微镜。虽然电子显微镜用电子束代替了光束，所以在理论上能够超越可见光波长的限制，但在实际观察生物大分子结构时却遇到了很多困难。本年度诺贝尔化学奖3位得主所做的工作，正是从不同的角度解决这些困难。

二维的晶体

电子显微镜研究生物大分子结构的第一个困难就是电子束本身的强大破坏力。简单来说，电子束中的电子是带着速度而来的，如果它们与样品发生了相互作用，也就意味着它们“撞”到了样品上。这个撞击产生的能量要样品自己来吸收，从而会导致样品的毁坏。很多无生命的样品在电子束的轰击之下都会发生明显可见的破坏，更不要说脆弱的蛋白质了。

怎么办呢？要说办法也简单，谁都能想得到，那就是减弱电子束的强度，减弱到不会明显破坏蛋白质样品的程度。可是，问题又来了：太弱的电子束成像也弱，如何能够得到清晰的电子显微镜成像呢？理查德·亨德森的贡献就在于此。他本来是从事X射线晶体学方法研究的。从这种经典方法中，他得到了启发，想到可以将二维晶体应用于电镜研究。我们所说的晶体，一般都是指三维晶体，其中的原子或分子在任意一个方向上都是周期排列的。X射线晶体学方法之所以能够得到微观结构信息的宏观信号，就是靠周期排列的晶格产生的X射线衍射作用。可是，三维的晶体太厚，电子束穿透的损耗太大。亨德森让特定的蛋白质形成了二维的晶体，也就是薄薄的一层在水平方向上有序排列的蛋白质，再让电子束去照射它，通过晶格的衍射来增强信号。

1990年，亨德森应用二维晶体方法解析得到了细菌视紫红质蛋白的三维结构。这种蛋白是一种膜蛋白，我们的眼睛能够看到光线，依赖的也正是视紫红质蛋白。略有遗憾的是，在此两年前，已经有结构生物学家通过X射线晶体学的方法解析得到了该蛋白的结构，从而使亨德森与相关诺贝尔奖失之交臂。但是，亨德森得到的结构是最早的应用电子显微镜技术测定得到的生物大分子结构。

全息“逮捕照”

我们在欧美电影中看到不少这样的情节：犯罪嫌疑人被警察抓获之后，都会举着自己的名牌在标尺墙前照3张照片——正面、左面、右面各一张。毫无疑问，这3张逮捕照的作用就是用来建立这名犯罪嫌疑人的样貌档案，以后如果在其他罪案有关的影像资料中拍到这个人，就可以很容易地进行比对识别了。我们不妨设想一下，如果不仅是建立一个人的平面照片档案，而是要建立一个人头部的三维立体模型呢？其实也不困难，只要360°无死角地给他拍一系列的头像照片就行了。如今的计算机建模程序已经可以轻松完成这样的任务。

那么，对于生物大分子的结构研究，可不可以照搬这个思路呢？约阿希姆·弗兰克给出了肯定的答案。他在20世纪80年代提出并完善了电子显微镜单颗粒重构技术，不再需要让蛋白质形成二维的晶体。说起来，二维晶体只是薄薄一层，似乎比形成三维晶体容易了许多，但其实二维结晶的难度与三维结晶并无太大分别。而单颗粒重构技术，顾名思义只需要单个蛋白质颗粒即可，无需任何形式的结晶。

具体来说，弗兰克首先要给散落在载网上的同一种蛋白质分子拍摄电子显微镜“照片”。拍照时，有的蛋白质可能是“正面”朝上，有的可能是“底面”朝上，也有可能是“左面”朝上，或者“右面”朝上。如果拍摄足够多的样品，有了足够多的照片之后，弗兰克就可以得到这种蛋白质在各个不同方向上的“照片”，就好像是全息的“逮捕照”一样。最后，通过数学计算的方法就能够重构这种蛋白质的三维结构模型。

你或许会想到一个问题：蛋白质分子不只是表面有原子，里面也有原子，如果只能拍到表面的照片，如何知道里面的结构信息呢？其实，这里说的“照片”并不是真正的照片，因为它是在样品底下接收到的电子束透射之后形成的投影影像。这种投影也跟阳光下的纯黑影子不同，因为电子束是从蛋白质中穿透而过的，所以受到了蛋白质内部原子的影响，带有了内部的结构信息。正因为如此，最终重构出来的才是蛋白质完整的三维结构。

冰的玻璃

亨德森和弗兰克的贡献似乎已经足以解决用电子显微镜研究蛋白质结构的问题了，但还少了一项重要技术，也就是冷冻电镜技术中的“冷冻”二字，它来自于雅克·杜邦内特的贡献。

我们都知道，生命离不开水。活细胞中每时每刻都发生着难以计数的生物化学反应，其中很多反应都有水分子的参与。而这还不是水对我们的唯一意义。如果我们能够缩小到原子水平的微观世界里直接观察，就会发现水溶液中的蛋白质表面牢牢地抓着几层水分子，甚至还有水分子紧密地结合到蛋白质的内部。这些水化层就是蛋白质表面的润滑剂，是蛋白质能够溶于水并发挥功能的关键所在。可以说，离开了水的蛋白质就不是蛋白质的真实模样了。

科学家希望看到蛋白质的真实模样，所以核磁共振是在水溶液中测量的，X射线晶体学的晶体是在水溶液中形成的，其内部充满了水。然而电子显微镜却有一个先天的不利因素：为了减低电子束与空气分子的撞击带来的种种问题，电子显微镜内部必须是绝对的真空环境。而在真空环境中，液态的水立刻就会汽化。好在水还有一种固体状态，那就是冰。冰可以在低温下于真空中稳定存在。可是，冰也有冰的问题。虽然一块冰整体上不是一个有序的晶体，但它其实是由无数微小的有序晶体组成的。所以在电子束的照射下，冰也会产生衍射，扰乱生物大分子本身的成像。

雅克·杜邦内特在20世纪80年代找到了解决这个问题的办法，那就是让水形成玻璃态的冰，也就是水分子仍然呈无序状态的冰。要做到这一点，就要让样品迅速降温，不给它结晶的时间。一般科学实验中用到低温环境时都会选择液氮，它化学上稳定，成本低，温度也足够低。但液氮却无法满足杜邦内特的要求，因为它的热容量太小，一接触常温的样品就被加热汽化了，在样品周围形成一个氮气的隔热层，阻止了进一步的快速降温。最终，杜邦内特选择了热容量足够大的液态乙烷，能够让样品瞬间降到接近零下200℃的温度，形成玻璃态的冰。这种方法一直延用至今，仍是用电子显微镜研究生物大分子结构时的最佳制样方法。

向“埃”靠拢

许多人或许会好奇：这3位科学家的贡献都已经是三四十年前的事情了，为什么诺贝尔奖委员会直到现在才颁奖给他们？事实上，虽然通过3位科学家的努力，冷冻电镜三维重构技术被用于蛋白质等生物大分子的结构研究，但是其分辨率一直比较低，徘徊在10埃以下，只有个别结构能够接近X射线晶体学的水平。而X射线晶体学的结构则能够轻松达到3埃以上的近原子分辨率水平。由于冷冻电镜结构的分辨率太低，无法精确定位原子坐标，无法提供结构细节，其应用就被大大限制了。

这种境况一直到近两三年来才有明显的改观，而其来源仍是技术的进步。在众多电镜技术的改进之中，最为重要的或许就是华人科学家程亦凡等人开发成功的直接对电子束成像的元器件。这种成像方式抛弃了原来通过接收电子束轰击来显像的荧光屏，改由微电子元件直接感受电子流，就像用CCD感受光线一样，从而大大提高了成像的清晰度，而且使得即时成像成为可能。有了即时成像技术，科学家就可以拍摄一段电子显微成像的视频，再分解成一帧帧的静止画面，把这些画面重新校准叠合，就能够有效解决样品在拍摄过程中的漂移问题，相当于相机用上了数码防抖功能，从而进一步提高了图像的清晰度。在这一系列新技术的推动之下，冷冻电镜方法的分辨率终于开始向“埃”的水平靠拢。

2013年，程亦凡等人应用新技术解析了人体感受温度的关键蛋白质——辣椒素受体的三维结构，向科学界展示了新型冷冻电镜技术在结构生物学研究中的美好前景。此后，越來越多的结构生物学家开始尝试使用冷冻电镜技术来研究蛋白质结构，并产出了一批高分辨率的重要结构成果。比如像剪切体这样的细胞器，因为过于巨大，在晶体学研究中被认为是不可能结晶的，而清华大学的施一公团队利用冷冻电镜技术已经成功解析了它的三维结构。在这种生物大分子组成的巨大“分子机器”的结构研究方面，冷冻电镜技术拥有着X射线晶体学和核磁共振技术都难以企及的巨大优势。

如今，冷冻电镜三维重构是结构生物学界最为炙手可热的研究方向。程亦凡、施一公等人的工作虽然没有为他们自己带来诺贝尔奖，却间接促成诺贝尔奖花落电镜领域。可以想见，这次颁奖必然会进一步唤起科学界对于冷冻电镜技术的重视与热情。现在，大多数冷冻电镜结构的分辨率仍然在3埃左右，只有个别案例能够达到2埃左右，但随着更多新技术新方法的涌现，它必然会坚定地朝着1埃的原子分辨率水平迈进，成为与X射线晶体学同等重要的结构生物学方法。

【责任编辑】庞 云

作者：谷第

来源：《百科知识》

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